Jeśli mam wskazać technikę biologii molekularnej, która budzi grozę wśród genetyków medycznych, to będzie to nCounter Nanostring. Jeśli o niej nie słyszeliście, to nie znaczy że coś jest z wami nie tak, albo że przespaliście jakąś rewolucję. Jest to dość nowa i do niedawna niszowa rzecz, która za kilka lat może przydać się w klinice. Tyle że pewien „wizjoner”, odpowiedzialny za wybór tematów do specjalizacji z Laboratoryjnej Genetyki Medycznej, już teraz wpisał tę nowatorską metodę do programu tejże specjalizacji. Efekt? Jest to naczelny temat, na którym idzie się wyłożyć na egzaminie.
Co to jest ten $&%*T#$ nanostring???
Technika Nanostring nCounter jest jedynym znanym obecnie sposobem na bezpośrednią identyfikację i pomiar ekspresji cząsteczek RNA. W przeciwieństwie do klasycznych metod transkryptomiki, opartych o sekwencjonowanie lub amplifikację cDNA, nanostring bazuje na hybrydyzacji wyznakowanych sond połówkowych bezpośrednio z cząsteczkami RNA. (coś jak wariacja na temat MLPA, mikromacierzy ekspresyjnej i FISHa, połączonych w jedną technikę…)
Takie ujęcie tematu pozwala na uniknięcie zaburzeń w proporcji transkryptów, powodowanych przez proces przepisywania RNA na komplementarną nić DNA, której prędkość i wydajność zależy od sekwencji nukleotydów. Metoda nanostring opiera się na dwóch sondach komplementarnych do niewielkiego (ok. 100pz) fragmentu danego transkryptu. Pierwsza z sond jest biotynylowana, co pozwala na hybrydyzację do układu pomiarowego (chip), druga posiada specyficzny fluorescencyjny znacznik, pozwalający swoiście oznaczyć dany transkrypt. Połączenie obu sond z transkryptem gwarantuje wysoką specyficzność pomiaru i pozwala na identyfikację konkretnego fragmentu RNA z zachowaniem jego proporcji wobec innych transkryptów identyfikowanych symultanicznie.
Na stronie producenta i dystrybutorów są o wiele ładniejsze ryciny. Warto tam zajrzeć.
Cały witz metody polega na zastosowaniu czterokolorowych tagów, którymi znakujemy transkrypty. Permutacja fluorochromów, podobnie jak index w NGSie, charakteryzuje konkretną cząsteczkę. Specjalny chip, do którego hybrydyzujemy próbkę, pozwala na odczyt fluorescencji o bardzo wysokiej rozdzielczości. Oprogramowanie zlicza sygnały charakterystyczne dla danego transkryptu i tworzy sygnaturę ekspresyjną danej puli RNA. Wg producenta możemy wyznakować do kilkuset różnych transkryptów, co więcej możemy to zrobić nawet w materiale FFPE albo w RNA zanieczyszczonym solami guanidyny (!). Ponieważ nie używamy żadnych enzymów, metoda jest prawie bezobslugowa, wymaga izolacji RNA, dodania sond, a nastepnie calonocnej hybrydyzacji i kilku przepłukiwań. Potem możemy nałożyć próbki na chip (do 12 naraz) i dokonać detekcji (ok 6h).
Gdzie może przydać się to ustrojstwo? Wszędzie tam gdzie na początku wieku próbowano wykorzystać profilowanie ekspresji genów przy pomocy mikromacierzy, ale okazało się to zbyt kłopotliwe i nie przyjęło się. Czyli np. w chorobach reumatycznych, w onkologii, a nawet mikrobiologii. Zresztą, nie muszą to być transkrypty kodujące gey białkowe, równie dobrze można profilować miRNA albo inne niekodujące cząsteczki kwasu rybonukleinowego. Co mnie osobiście fascynuje najbardziej, to możliwość detekcji dowolnych genow fuzyjnych w bialaczkach i mięsakach! Ale to byłoby fajowe! (https://www.sciencedirect.com/science/article/pii/S1525157821002397)
Genevra: the woman of Genomics 